高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類(lèi)型。用不同類(lèi)型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。?

高效液相色譜法的主要類(lèi)型及其分離原理?

根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類(lèi)型：?

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1?．液?—?液分配色譜法(Liquid-liquid?Partition?Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically?Bonded?Phase?Chromatography)?

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流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于下式：?

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式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm－－溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度；?Vs—固定相的體積；Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。?

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a.?正相液?—?液分配色譜法(Normal?Phase?liquid?Chromatography):?流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。?

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b.?反相液?—?液分配色譜法(Reverse?Phase?liquid?Chromatography):?流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。?

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c.?液?—?液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見(jiàn)后），可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70~80%）。?

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2?．液?—?固色譜法?

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流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子?(X)?和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：?

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Xm?+?nSa?======?Xa?+?nSm?

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式中：Xm－－流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa－－固定相中的溶劑分子；Xa－－固定相中的溶質(zhì)分子；Sm－－流動(dòng)相中的溶劑分子。?

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當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：?

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K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]?

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式中：K為吸附平衡常數(shù)。[討論：K越大，保留值越大。]?

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3?．離子交換色譜法(Ion-exchange?Chromatography)?

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IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。?

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以陰離子交換劑為例，其交換過(guò)程可表示如下：?

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X-(溶劑中)?+?(樹(shù)脂-R4N+Cl-)===?(樹(shù)脂-R4N+?X-)?+?Cl-?(溶劑中)?

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當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：?

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KX=[-R4N+?X-][?Cl-]/[-R4N+Cl-][?X-]?

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分配系數(shù)為：?

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DX=[-R4N+?X-]/[X-]=?KX?[-R4N+Cl-]/[Cl-]?

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[討論：DX與保留值的關(guān)系]?

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凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。?

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4?．離子對(duì)色譜法(Ion?Pair?Chromatography)?

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離子對(duì)色譜法是將一種?(?或多種?)?與溶質(zhì)分子電荷相反的離子?(?稱(chēng)為對(duì)離子或反離子?)?加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式表示：?

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X+水相?+?Y-水相?===?X+Y-有機(jī)相?

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式中：X+水相－－流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽(yáng)離子）；Y-水相－－流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y－－-形成的離子對(duì)化合物。?

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當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：?

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KXY?=?[X+Y-]有機(jī)相/[?X+]水相[Y-]水相?

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根據(jù)定義，分配系數(shù)為：?

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DX=?[X+Y-]有機(jī)相/[?X+]水相=?KXY?[Y-]水相?

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[討論：DX與保留值的關(guān)系]?

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離子對(duì)色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。?

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5?．離子色譜法(Ion?Chromatography)?

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用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。?

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以陰離子交換樹(shù)脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過(guò)程）：?

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抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：?

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R-H+?+?Na+OH-?===?R-Na+?+?H2O?

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R-H+?+?Na+Br-?===?R-Na+?+?H+Br-?

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可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H+Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè)。?

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離子色譜法是溶液中陰離子分析的最好方法。也可用于陽(yáng)離子分析。?

6?．空間排阻色譜法(Steric?Exclusion?Chromatography)?

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空間排阻色譜法以凝膠?(gel)?為固定相。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。